【摘要】本發明公開了一種潛水泵仿真制造方法包括以下步驟：(1)根據設計參數進行水力設計；(2)在分步式協同設計平臺上建立潛水泵零部件的三維數字產品模型；(3)通過產品數據管理平臺將三維數字產品模型提供給各領域仿真工具進行虛擬仿真；(4)在協
【摘要】 本發明提供一種同步檢測多種小分子化合物的 試劑的制備方法及其使用方法。制備步驟如下：制備編碼微球 試劑；制備小分子化合物抗體探針－熒光量子點抗體探針、熒 光量子點二抗探針、熒光染料抗體探針或熒光染料二抗探針之 一。本發明的使用方法——檢測小分子化合物的方法：抗體探 針直接法、抗體探針間接法。采用本發明制備的試劑或本發明 提供的試劑盒可用于食品、農產品、活體動物及人體中獸藥、 農藥、違禁藥物、濫用藥物等中的小分子化合物的檢測，重復 性好、靈敏度高；簡便、快速、能進行現場；試劑耗量小，測 試成本低廉；可多靶標同步分析；易于普及推廣；從而達到對 危害物質能及時發現和監控管理。 【專利類型】發明申請 【申請人】鄒明強 【申請人類型】個人 【申請人地址】100025北京市朝陽區高碑店北路－甲3號中國檢驗檢疫科學研究院 【申請人地區】中國 【申請人城市】北京市 【申請人區縣】朝陽區 【申請號】CN200610113903.6 【申請日】2006-10-20 【申請年份】2006 【公開公告號】CN1945331A 【公開公告日】2007-04-11 【公開公告年份】2007 【授權公告號】CN1945331B 【授權公告日】2011-06-08 【授權公告年份】2011.0 【IPC分類號】G01N33/533; G01N33/577; G01N33/546; G01N33/544 【發明人】鄒明強; 李錦豐; 高海霞 【主權項內容】1.一種同步檢測多種小分子化合物的試劑的制備方法，其步驟如下： 1)制備編碼微球試劑 (1)制備小分子化合物全抗原：使小分子化合物通過化學反應與牛血清蛋白或卵清 蛋白載體進行蛋白偶聯，得到小分子化合物全抗原；小分子化合物為孔雀石綠、結晶紫、鹽 酸克倫特羅、氯霉素、萊克多巴胺、沙丁胺醇、硝基呋喃類獸藥代謝物、磺胺、鏈霉素、甲 胺磷、對硫磷、甲萘威、甲霜靈或嗎啡之一；用分光光度計測定制備好的小分子化合物全抗 原的濃度，用摩爾濃度為0.01M、PH＝7.4的磷酸鹽緩沖溶液稀釋到質量濃度為1mg/ml； (2)配制磷酸鹽-氫氧化鈉緩沖溶液：用當量濃度為5N的氫氧化鈉水溶液調節摩 爾濃度為0.1M的NaH2PO3水溶液的酸度，使pH＝6.0-6.5； (3)微球活化：取1-5μL顆粒直徑為3-10μm、熒光顏色為紅、橙、黃或綠之一 及熒光強度為1至8級之一的聚苯乙烯熒光微球，先放入超聲波清洗器中超聲30s，然后放 入渦旋振蕩器中振蕩10s，再加入離心管中，再加入200-500μL上述磷酸鹽-氫氧化鈉緩沖 溶液，混合均勻；經3, 000rpm離心20分鐘，倒掉廢液；然后每次用200μL磷酸鹽-氫氧 化鈉緩沖溶液洗滌，洗滌2-3次，；再加入80-300μL上述磷酸鹽-氫氧化鈉緩沖溶液、5-20 μL質量濃度為50mg/ml的NHS和5-20μL質量濃度為50mg/ml的EDC，避光搖振20min； 經3, 000rpm離心20分鐘，倒掉廢液；然后每次用200μL摩爾濃度為0.01M、PH＝7.4的PBS 洗滌，洗滌2-3次，再溶于50-300μL摩爾濃度為0.01M、PH＝7.4的PBS溶液中，得到活化 微球液； (4)小分子化合物全抗原在微球上的固定化：取上述活化微球液80-100μL，加入 到離心管中，再加入10-20μL上述制備的質量濃度為1mg/mL的小分子化合物全抗原，避光 搖振0.5-2小時，經3, 000rpm離心20分鐘，倒掉廢液；得到已固定化小分子化合物全抗 原的微球； (5)配制封閉液：用摩爾濃度為0.01M、PH＝7.4的PBS溶解BSA使其重量百分比濃 度為2-10％；再加入NaN3使重量百分比濃度為0.02-0.03％，混合均勻，得到封閉液； (6)已固定化小分子化合物全抗原的微球的封閉：向上述已固定化小分子化合物全 抗原的微球中加入200μL上述封閉液，然后放入渦旋振蕩器中振蕩10s，避光搖振1-2小時， 于4℃放置10-15小時，使微球封閉；再每次用100-200μL封閉液洗，洗滌2次，用摩爾 濃度為0.01M、PH＝7.4的PBS定容至100-200μL，即制得編碼微球試劑； 2)制備小分子化合物抗體探針 (1)制備熒光量子點抗體探針 ①基于上述小分子化合物全抗原，對小鼠或大鼠利用雜交瘤技術通過細胞融合， 克隆篩選小分子化合物單克隆抗體；或者用制得的小分子化合物全抗原分別免疫兔、羊或雞， 制備篩選特異性好的小分子化合物多克隆抗體； ②用硫酸銨分級沉淀法和柱層析分離提純技術分別對上述小分子化合物單克隆抗 體或小分子化合物多克隆抗體進行純化，用分光光度計測定純化后小分子化合物單克隆抗體 或小分子化合物多克隆抗體的質量濃度； ③制備熒光量子點抗體探針：用摩爾濃度為0.1M、pH＝7.4的Na3PO4溶液溶解上 述純化后的小分子化合物單克隆抗體或小分子化合物多克隆抗體，使其質量濃度為10mg/mL， 得到小分子化合物抗體溶液；取2mL小分子化合物抗體溶液，加入在水相合成的摩爾濃度為 0.00125mol/L？CdTe量子點溶液0.5-2mL，混合均勻后，再加入質量濃度為0.6mg/ml的EDC 1mL，將反應體系用摩爾濃度為0.01M、PH＝7.4的Na3PO4溶液補足至5mL，室溫下避光反應 2h；在4℃條件下，用400mL摩爾濃度為0.01M的Na3PO4、摩爾濃度為0.15M的NaCl、 pH？7.4的透析液對反應液進行透析，透析袋截流量為10000-30000，每6h換一次透析液， 共計30h；得到熒光量子點抗體探針； (2)制備熒光量子點二抗探針：用抗小鼠、大鼠、兔、羊或雞之一IgG抗體替換上 述小分子化合物的單克隆抗體或小分子化合物的特異性好的多克隆抗體，其余步驟按制備熒 光量子點抗體探針的步驟操作，即可制得熒光量子點二抗探針； (3)制備熒光染料抗體探針：PE或FITC熒光染料對上述小分子化合物的單克隆 抗體或小分子化合物的特異性好的多克隆抗體，進行標記，標記步驟如下： ①抗體、PE或FITC的預處理： a.將上述5mg小分子化合物的單克隆抗體或小分子化合物的特異性好的多克 隆抗體每次用400ml含質量百分比濃度為0.05％的NaN3，pH7.2、摩爾濃度為10mM的PBS緩 沖液進行透析，透析3-4次，其間更換緩沖液，每次透析時間為3-4小時，最后一次透析過 夜； b.將5mg？PE或FITC每次用400ml含摩爾濃度為50mM的NaH2PO4、摩爾濃度為 2mM的EDTA、pH？7.0緩沖液進行透析，透析3-4次，其間更換緩沖液，每次透析時間為3-4 小時，最后一次透析過夜； c.上述透析后的抗體、PE或FITC分別經10, 000rpm，4℃離心10分鐘去除 沉淀；用分光光度計分別測定抗體、PE或FITC的質量濃度； ②PE或FITC的衍生化 a.取Sephadex？G-25層析柱，用5倍柱床體積含摩爾濃度為50mM的MES、摩 爾濃度為2mM的EDTA、pH？6.0的交換緩沖液平衡； b.按照每mg上述經透析PE或FITC中加入10-13μL的摩爾濃度為10mg/mL 的SMCC的DMSO溶液的比例加入SMCC，室溫避光搖振反應60min；加入平衡后的Sephadex？G-25 層析柱中去除游離的SMCC，收集PE或FITC，得到衍生化的PE或FITC；用分光光度計測定 衍生化的PE或FITC質量濃度； ③抗體的還原 a.ephadex？G-25層析柱用5倍柱床體積含摩爾濃度為50mM的MES、摩爾濃 度為2mM的EDTA、pH？6.0的交換緩沖液平衡； b.按照每mL上述經透析的抗體溶液中加入20μL的摩爾濃度為1M的DTT的比 例加入DTT，室溫避光搖振反應30min；加入平衡后的Sephadex？G-25層析柱中去除游離的 DTT，收集抗體部分，得到還原后的抗體；用分光光度計測定抗體質量濃度； ④PE或FITC和抗體的共價交聯 a.將上述還原后的抗體按照1個IgG分子結合1-3個PE或FITC分子的比例逐 滴加入到上述衍生化的PE或FITC中，邊加邊攪動；室溫避光振蕩反應2小時；得到PE-抗 體或FITC-抗體；用分光光度計測定PE-抗體或FITC-抗體質量濃度； b.向每mg上述PE-抗體或FITC-抗體中加入0.34μL摩爾濃度為10mg/mL的 NEM的DMSO溶液的比例加入NEM進行封閉，室溫避光搖振反應20min；然后置蛋白截流量為 30, 000的濃縮器中濃縮；濃縮比為3-4∶1； ⑤凝膠分離純化 a.Sephacryl？S-300層析柱用5倍柱床體積含摩爾濃度為10mM的PBS、摩爾 濃度為1M的Urea尿素、質量百分比濃度為0.05％的NaN3、pH7.2緩沖液平衡，其中柱體包裹 錫箔紙進行避光； b.利用經緩沖液平衡的Sephacryl？S-300層析柱對上述濃縮后的PE-抗體或 FITC-抗體進行純化，根據洗脫曲線收集合格的標記產品，得到純化后的PE-抗體或FITC-抗 體； c.將上述純化后的PE-抗體或FITC-抗體分別每次用400ml含質量百分比濃度 為0.05％的NaN3、pH7.4、摩爾濃度為100mM的PBS緩沖液進行透析，透析3-4次，其間更換 緩沖液，每次透析時間為3-4小時，最后一次透析過夜；然后置蛋白截流量為30, 000的濃縮 器中濃縮；濃縮比為3-4∶1，得到純化后的PE-抗體或FITC-抗體的濃縮液； d.將上述純化后的PE-抗體或FITC-抗體的濃縮液分別經10, 000rpm，4℃ 離心10分鐘去除沉淀，制得PE-抗體探針和FITC-抗體探針； (4)制備熒光染料二抗探針：用抗小鼠、大鼠、兔、羊或雞之一IgG抗體替小分子化 合物的單克隆抗體或特異性好的多克隆抗體，其余步驟按制備熒光染料抗體探針中步驟進行 操作，即可制得熒光染料二抗探針。。 【當前權利人】鄒明強 【當前專利權人地址】北京市朝陽區高碑店北路甲3號中國檢驗檢疫科學研究院 【被引證次數】44 【被他引次數】44.0 【家族引證次數】4.0 【家族被引證次數】44
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